Hypoxian osuudesta, HIF1

Research Report 

Naringenin and quercetin reverse the effect of hypobarichypoxia and elicit neuroprotective response in the murine model

 Aditi Sarkar

, M. Sonia Angeline

, Kushi Anand

, Rashmi K Ambasta

, Pravir Kumar

Functional genomics and Cancer biology laboratory, Center for Medical Engineering, Vellore Institute of Technology, Vellore,TN 632014, India

Department of Biotechnology, Delhi Technological University, Delhi 110042, India

Department of Neurology, Adjunct faculty, Tufts University School of Medicine, Boston, MA, USA

Accepted 21 August 2012Available online 6 September 2012

Keywords:

Hypobaric-hypoxiaHIF1

Flavonoids Neuroprotection Caspase Ubiquitin

a b s t r a c t

Exposure to high-altitude results in hypobaric hypoxia which is considered as an acute physiological stress. This condition often leads to high-altitude illnesses such as high-altitude cerebral edema, high altitude pulmonary edema and hypoxic muscle weakness.Hypoxic injuries can be prevented by either preconditioning with cobalt chloride or treatment with drugs. The aim of current investigation was to evaluate the effect of naringenin (NGEN) and quercetin (QUR) against behavioral impairment and neuronal damage in hypoxia induced murine model. An oral administration of NGEN or QUR (10 mg/kg each) was given to the animal prior to every hypoxic treatment. Behavioral changes were evaluated along with the hypoxia exposure for all the groups. After hypoxia exposure and drug administration, the mice were euthanized; brains were harvested and stored for further analysis. Expressions of hypoxia induced proteins were ensured by Western blotting. Our results demonstrate expression of hypoxia inducible factor 1a (HIF1a), vascular endothelialgrowth factor (VEGF), active caspase 3 and ubiquitin levels were significantly reduced upon drug treatment. However, expressions of chaperones (Hsp70, Hsp90 and C-terminus Hsp70 interacting protein) were moderately changed. We established our findings based on behavioral test, hematoxylin and eosin as well as amino-cupric silver stainings. In addition, the protective nature of these drugs was corroborated with immunoblot and immunofluor-escence results, where we confirmed the down regulation of caspase 3 and ubiquitinated       proteins
.To  conclude, treatment 
with  NGEN andQUR alonesubstantially amelioratedhypoxiainduced brain dysfunction and acts like a neuroprotectant.

.http://dx.doi.org/10.1016/j.brainres.2012.08.036Abbreviations: HIF1

a

, Hypoxia inducible factor 1a

; VEGF, Vascular endothelial growth factor; HSPs, Heat shock proteins;CHIP, C-terminus Hsp70 interacting protein; NGEN, Naringenin; UPS, Ubiquitin proteasome system; QUR, Quercetin;Ub, Ubiquitin; FITC, Fluorescein isothiocyanate; HRP, Horse radish peroxidase

n

Correspondence to: Delhi Technological University (Formerly Delhi Colleg

Kupari ja rintasyöpä

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24955214

SOD entsyymit ovat kupari/sinkkientsyymeitä
Mitokondriassa on SOD2 ja mitokondriat ovat  äidiltä periytyviä.

• J Inorg Biochem. 2014 Oct;139:117-23. doi: 10.1016/j.jinorgbio.2014.06.007. Epub 2014 Jun 17.

Synthesis, structural characterization and cytotoxic activity of ternary copper(II)-dipeptide-phenanthroline complexes. A step towards the development of new copper compounds for the treatment of cancer.

Iglesias S¹, Alvarez N¹, Torre MH¹, Kremer E¹, Ellena J², Ribeiro RR³, Barroso RP⁴, Costa-Filho AJ⁴, Kramer MG⁵, Facchin G⁶.

Abstract

In the search for new compounds with antitumor activity, coordination complexes with different metals are being studied by our group. This work presents the synthesis and characterization of six copper complexes with general stoichiometry [Cu(L-dipeptide)(phen)]·nH2O (were phen=1,10-phenanthroline) and their cytotoxic activities against tumor cell lines. To characterize these systems, analytical and spectroscopic studies were performed in solid state (by UV-visible, IR, X-ray diffraction) including the crystal structure of four new complexes (of the six complexes studied): [Cu(Ala-Phe)(phen)]·4H2O, [Cu(Phe-Ala)(phen)]·4H2O, [Cu(Phe-Val)(phen)]·4.5H2O and [Cu(Phe-Phe)(phen)]·3H2O. In all of them, the copper ion is situated in a distorted squared pyramidal environment. The phen ligand is perpendicular to the dipeptide, therefore exposed and potentially available for interaction with biological molecules. In addition, for all the studied complexes, structural information in solution using EPR and UV-visible spectroscopies were obtained, showing that the coordination observed in solid state is maintained. The lipophilicity, DNA binding and albumin interaction were also studied. Biological experiments showed that all the complexes induce cell death in the cell lines: HeLa (human cervical adenocarcinoma), MCF-7 (human metastatic breast adenocarcinoma) and A549 (human lung epithelial carcinoma). Among the six complexes, [Cu(Ala-Phe)(phen)] presents the lowest IC50 values. Taken together all these data we hypothesize that [Cu(Ala-Phe)(phen)] may be a good candidate for further studies in vivo.
Copyright © 2014 Elsevier Inc. All rights reserved.

KEYWORDS:

Copper complexes; Cytotoxic activity; DNA interaction; Dipeptide; Phen

• PLoS One. 2014 Sep 5;9(9):e107058. doi: 10.1371/journal.pone.0107058. eCollection 2014.

Copper (II) and 2,2'-Bipyridine Complexation Improves Chemopreventive Effects of Naringenin against Breast Tumor Cells.

Filho JC¹, Sarria AL², Becceneri AB¹, Fuzer AM¹, Batalhão JR², da Silva CM², Carlos RM², Vieira PC², Fernandes JB², Cominetti MR¹.

Abstract

Cancer is the second leading cause of death worldwide and there is epidemiological evidence that demonstrates this tendency is emerging. Naringenin (NGEN) is a trihydroxyflavanone that shows various biological effects such as antioxidant, anticancer, anti-inflammatory, and antiviral activities. It belongs to flavanone class, which represents flavonoids with a C6-C3-C6 skeleton. Flavonoids do not exhibit sufficient activity to be used for chemotherapy, however they can be chemically modified by complexation with metals such as copper (Cu) (II) for instance, in order to be applied for adjuvant therapy. This study investigated the effects of Cu(II) and 2,2'-bipyridine complexation with naringenin on MDA-MB-231 cells. We demonstrated that naringenin complexed with Cu(II) and 2,2'-bipyridine (NGENCuB) was more efficient inhibiting colony formation, proliferation and migration of MDA-MB-231 tumor cells, than naringenin (NGEN) itself. Furthermore, we verified that NGENCuB was more effective than NGEN inhibiting pro-MMP9 activity by zymography assays. Finally, through flow cytometry, we showed that NGENCuB is more efficient than NGEN inducing apoptosis in MDA-MB-231 cells. These results were confirmed by gene expression analysis in real time PCR. We observed that NGENCuB upregulated the expression of pro-apoptotic gene caspase-9, but did not change the expression of caspase-8 or anti-apoptotic gene Bcl-2. There are only few works investigating the effects of Cu(II) complexation with naringenin on tumor cells. To the best of our knowledge, this is the first work describing the effects of Cu(II) complexation of a flavonoid on MDA-MB-231 breast tumor cells.

ADAMTS, MMP , crosslinking ( solufysiologiaa)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3602650/figure/F1/

LOX säätyminen

http://www.bloodjournal.org/content/120/9/1774?sso-checked=true 
LOX  megakaryosyyttein patologiassa 


http://cardiovascres.oxfordjournals.org/content/79/1/7/F2.expansion

Lysyylioksidaasi LOX on kuproentsyymi. , lysyl-tyrosyl-kinoni. , joka aiheuttaa sivutuotteena H2O2

Tästä huomaa että  entsyymillä on kinonirakenne. Onkohan se xenobioottinenkin?  Sen sivutuote on H2O2.  Luulisi siinä tapauksessa että sen säätyminen ylös on kudokselle haitallinen.   Ja samalla sen  normaali funktio  vaikuttuu myös ravinnosta.
 http://ajcn.nutrition.org/content/67/5/996S.full.pdf
 LOX on kuproentsyymi proteiinilysiini-6-oksidaasi, joka on essentielli ECM- stabiloija tehden poikkisidoksia kollageeniin ja elastiiniin.  On tehty oletus, mikä assosioi dieetin kuparipitoisuudet LOX- entsyymin dynaamiikkaan ja suhteellisiin muutoksiin sidekudoksessa esiintyvässä aktiivisuudessa.  Vaikkakaan ravinnon kuparistatus ei vaikuta lysyylioksaidaasin kertymää proteiinina eikä  lysyylioksidaasin  mRNA:n pitoisuuden  tasapainoon
Hypoteesi perustuu siihen mahdollisuuteen, että  kuparin ulosvuodolla solusta ja  lysyylioksidasin sekretiolla soluista  saattaa olla yhteinen tie. Funktionaalisen aktiivisuuden muutos on todennäköisemmin tulsota posttranslationaalisesta  lysyylioksidasin prosessoinnista.  Kupari on essentielli  cofactor  aminioksidaasien kuten LOX muodostuksessa. Kuparia sisältävissä aminioksidaaseissa on aktiivissa keskuksessa  TOPA, tri-oxo-fenylalaniini . Tämä  fenyyliltään   kolmasti  oksidoitunut fenylalaniini trioxo-Phe  muodostuu tyrosiinista (Tyr)  käsin ja tämä posttranslationaali tapahtuma  tapahtuu Golgi- Trans-Golgi prosessoitumisen aikana . Lysyloksidaasin (LOX) suhteen  tapahtuu vielä toinen posttranslationaalinen  askel : Lysyloksidaasin aktiivin kohdan lysyyliryhmä reagoi tämän TOPA:n kanssa tai sen prekursorimolekyylin  tyrosiinin kanssa  muodostaen  Lys-Tyr- kinonia.

ABSTRACT

Protein-lysine 6-oxidase (lysyl oxidase) is a

cuproenzyme that is essential for stabilization of extracellular

matrixes, specifically the enzymatic cross-linking of collagen and

elastin. A hypothesis is proposed that links dietary copper levels

to dynamic and proportional changes in lysyl oxidase activity in

connective tissue. Although nutritional copper status does not

influence the accumulation of lysyl oxidase as protein or lysyl

oxidase steady state messenger RNA concentrations, the direct

influence of dietary copper on the functional activity of lysyl oxi-

dase is clear. The hypothesis is based on the possibility that cop-

per efflux and lysyl oxidase secretion from cells may share a

common pathway. The change in functional activity is most like-

ly the result of posttranslational processing of lysyl oxidase. Cop-

per is essential for organic cofactor formation in amine oxidases

such as lysyl oxidase. Copper-containing amine oxidases have

peptidyl 2,4,5 tri(oxo)phenylalanine (TOPA) at their active cen-

ters. TOPA is formed by copper-catalyzed oxidation of tyrosine,

which takes place as part of Golgi or trans-Golgi processing. For

lysyl oxidase, recent evidence (Science 1996;273:1078–84) indi-

cates that as an additional step, a lysyl group at the active center

of lysyl oxidase reacts with TOPA or its precursor to form lysyl

tyrosylquinone.

Am J Clin Nutr

1998(suppl);67:996S–1002S.

KEY WORDS

Copper, protein-lysine 6-oxidase, lysyl oxi-

dase, collagen, elastin, protein cross-linking, Golgi complex,

extracellular matrix

Rintasyövän matrixmetalloproteinaasit- haku antaa 2329 löytöä

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=metalloproteinases+in+breast+cancer

Mielenkiintoinen artikkeli keramidisyntaasista  Tähänhän voi vaikuttaa moduloiden ravinnolla. (tyyppi:broccoli)
 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25213553
Tämän sfingomyeliinikatabolian ja  anabolian kartan  normaalit kofaktorit  kannattaa kartoittaa itselleen. ( Tästä minulla on enemmän  K-vitamiinin aineenvaihdunnan  ohessa ja rikkiaineenvaihdunnan yhteydessä sekä Veri ja hyytyminen - blogissani)  Tässä vain ydinasiat: keramidien  kohdalta.

Kts.  vaikkapa  Wikipedialähteen  de novo  synteesitie: Se on aminohaposta joka aktivoituu B6 vitamiinilla ja  sitten tarvitaan K-vitamiinia jota saadaan aikaan alkumuutos dihydrosfingosiiniksi, josta sitten keramidi syntyy-  lopputuote tästä tiestä  on esim. normaalia kalvorakenteisiin sijoittuvaa  myeliinin  molekyyliä sfingomyeliiniä  ja muitakin  on jotka vaativat  keramidivaiheen (  sulfatidit, glykolipidit)
  Esim D- vitamiinia tarvitaan  säätelemässä  sfingomyeliinin  katabolista tietä ja sieltä purkautuvaa ainesta voidaan uudelleen palauttaa  takaisin "keramidi- keskusasemalle"ja  siiitä  menee ratoja taas  uudestaan sfingomyeliiniksi ( ja  glykosfingolipideihin, sulfatideihin)  (The salvage  parhway)
 Jos  tämä  kiertokulku( turn over , mikä tapahtuu esim aivolipideissä)  ei toimi normaalisti ja tasapainosiesti- siis  se voi  vaurioitua kummastakin  suunansta,  de novo- suunansta  esim se  haittaantuu homemyrkyistä ja   salvage tien suunansta   taas johtaa helposti  haitallisiin fosforyloituneisiin  tumasäätelyä  muuntaviinkin  sfingomyeliinimetaboliiteihin (SPP) joista ei ole kaukana  karsinogeenisyyskään ja muut metaboliset häiriöt. varsinkin  aktiivin kalsiummolekyylin säätelyn   funktionaaliset häiritsemiset ( delayed deregulation tyyppiset)
 keramidisyntasi voi  pelastaa ( rescue) sfingosiinia takaisin  turn over- tapahtumiin ja rakentamaan hyvia  membraaneja etei se lähde fosforyloitumaan  ja kohti   sfingomyeliini,metaboliitien  sfingoidien emasten  fosforyloituneitten tumasäätäjien tielle.  Sivutuote on myös rasvahapon aldehydiä.

De novo

De novo synthesis of ceramide begins with the condensation of palmitate and serine to form 3-keto-dihydrosphingosine. This reaction is catalyzed by the enzyme serine palmitoyl transferase and is the rate-limiting step of the pathway. In turn, 3-keto-dihydrosphingosine (Ksa)  is reduced to dihydrosphingosine, which is then followed by acylation by the enzyme (dihydro)ceramide synthase to produce dihydroceramide. The final reaction to produce ceramide is catalyzed by dihydroceramide desaturase. De novo synthesis of ceramide occurs in the endoplasmic reticulum. Ceramide is subsequently transported to the Golgi by either vesicular trafficking or the ceramide transfer protein CERT. Once in the Golgi apparatus, ceramide can be further metabolized to other sphingolipids, such as sphingomyelin and the complex glycosphingolipids.^[2]

The salvage pathway

Constitutive degradation of sphingolipids and glycosphingolipids takes place in the acidic subcellular compartments, the late endosomes and the lysosomes. In case of glycosphingolipids, exohydrolases, acting at acidic pH optima, cause the stepwise release of monosaccharide units from the end of the oligosaccharide chains one after the other leading to the generation of ceramide whereas sphingomyelin is converted to ceramide by acid sphingomyelinase. Ceramide can be further hydrolyzed by acid ceramidase to form sphingosine (So)  and a free fatty acid (FFA) , both of which are able to leave the lysosome in contrast to ceramide. The long-chain sphingoid bases released from the lysosome may then re-enter pathways for synthesis of ceramide and/or sphingosine-1-phosphate (So-1-P) The salvage pathway re-utilizes long-chain sphingoid bases to form ceramide through the action of ceramide synthase. Thus, ceramide synthase family members probably trap free sphingosine (So)  released from the lysosome at the surface of the endoplasmic reticulum or in endoplasmic reticulum-associated membranes. It should also be noted that the salvage pathway has been estimated to contribute from 50% to 90% of sphingolipid biosynthesis ^[3]

Physiological roles of ceramide

As a bioactive lipid, ceramide has been implicated in a variety of physiological functions including apoptosis, cell growth arrest, differentiation, cell senescence, cell migration and adhesion.^[2] Roles for ceramide and its downstream metabolites have also been suggested in a number of pathological states including cancer, neurodegeneration, diabetes, microbial pathogenesis, obesity, and inflammation.^[4][5]

Rintasyövän metastasoitumisesta väitöskirja 2014 . Metastasoitunut rintasyöpä on edelleen parantumaton tauti.

•  RINTASYÖPÄ on  tavallisimpia syöpämuotoja ja kohtaa yli 10 prosenttia länsimaisista naisista. Yli 90 % rintasyövästä johtuvista kuolemantapauksista eivät johdu rintasyövän primäärituumorista,  vaan sen lähettämistä etäiskasvannaisista, metastaaseista. . Vaikka on suuresti edistytty rintasyövän hoidossa, niin metastasoitunut  rintasyöpä on edelleen  parantumaton tauti.  Tämän takia on tärkeää hankkia lisää tietoa ja ymmärtämystä siitä, miten erilaiset signalointitiet osallistuvat kasvaimen  etenemiseen,  sillä  hankittu tieto voi siten toivon mukaan johtaa metastaattista rintasyöpää sairastavien potilaiden  uusiin ja parempiin terapioihin   Nykyisellään imusolmukemetastaasien  katsotaan  olevan  kaikkein tärkein prognostinen  merkitsijä rintasyövässä ja imusolmukemetasaasien   lukumäärä on opppaana informoivin   valittaessa adjuvanttiterapiaan sopivinta strategiaa. 

 Onko muita   merkitsijöitä löydettävissä, jotka voisivat  tarkentaa  terapiaa?  - Tätä on punnittu väitöskirjassa.

Väitöskirja:https://gupea.ub.gu.se/bitstream/2077/35940/1/gupea_2077_35940_1.pdf
Ylläolevasta saa abstraktin, joka on todella tiivistä tekstiä.  Kirjotan ensin  johdannosta asian, ennen kuin edes ajattelen suomentaa  tiivistelmää.  Kirja sisälsi  yhden kartan tutkituista tekijöistä ja  sanottiin että olisi mielenkiintoista tietää,  miten kartta  vaikuttavine tekijöineen  jatkuu ( ja missä yhteydesäs se on aiempaan  kartastoon) tämän alan signaaliteissä. 

Gisela Nilsson.  Molecular factors influencing epithelial- mesenchymal transition in breast cancer.  ISBN 978- 91-628-9116-9

( Kävin kuuntelemassa tätä väitöskirjaa viime viikon perjantaina  Sahlgrenskan Akatemiassa  ja koetin pureutua asian ytimeen. Esittelyosa oli englanniksi ja keskusteluosa ruotsiksi ja kirja oli saatavilla kaikille kuuntelijoille).

Työssä ilmenevien molekyylien ja termien luettelo ja niiden lyhennyksiä

(Täydennän sitä mukaa kuin luen)

BCSS Breast Cancer- Specific Survival Spesifinen elossapysyvyys rintasyövässä

CDH-1,  Cadherin 1

CSC,  Cancer Stem Cell, syöpäkantasolu

CTC Circulating cancer cell, kiertävä syöpäsolu

E- Cadherin , C-C Adhesion Molecule , Epithelial specific

ECM, Extrasellular matrix

EGF , Epidermal Growth factor, epidermaalinen kasvutekijä

EGFR edellisen reseptori

EMT, Epithelial-mesenchymal transition, epiteliaalisesta mesenkymaaliseksi siirtymä

ER Estrogen Receptor, estrogeenireseptori

FAK, Focal Adhesion Kinase, entsyymi, joka vaimenee FoxF1/LOX aktivaatiosta

FGF, Fibroblast Growth factor

Fox, Forkhead box

FoxF1 säätää ylös LOX ( invasiivisuus, osallistuu metastasoitumiseen)

Hedgehog

HIF- 1, Hypoxia Inducible Factor- 1

Jak2, janus-tyrosine kinase 2, entsyymi

LOX, lysyloxidase, ECM- entsyymi , vahvistaa poikkisidoksia kollageenissa tai elastiinissa (LOX Sivutuote H2O2)

LOXL, LOX-like ( 1-4)

MAPK, mitogen activated protein kinase, entsyymi

MET, mesenchymal-epithelial transition, mesenkymaalisesta epiteliaaliseksi siirtymä

miRNA, microRNA

N-Cadherin, mesenchymal specific

NF1, Nuclear factor 1, tumatekijä 1

NF1-C2, säätää alas LOX ja FoxF1. Kadonnut useissa progredioivissa tuumoreisa ja imusolmuke- metastaseissa

NF-kB, Nuclear Factor-kB

NGF, Nerve Growth factor, hermonkasvutekijä

Notch

p38 phosphorylated , elevated in aggressive breast cancer

p38/MAP/non-smad

p130Cas

PDGF, Platelet-Derived Growth Factor, verihiutaleperäinen kasvutekijä

PI3K, Phosphatidyl Inositol- 3-Kinase., entsyymi; Signalointitie

PR Progesterone Receptor, progesteronireseptori

Raf/MAPK signalointitie

Ras, (signalointitie)

Rho family, GTPase

RFS Recurrence-free survival , hengissäpysymisaika ilman taudin palaamista

RTK, Receptor Tyrosine Kinase, entsyymi

Smad2/3, non-Smad imbalance  ( KTS: SMAD proteiinit ja geenit)

Src

Slug (Snail1, Snail2) ranskriptiotekijöitä (KTS. SNAIL  superperhe)

Smad2 , aktivoituu FAK entsyymillä

TGF- beta, Transforming Growth factor Beta, kasvutekijä TGF beta

Twist1, Twist2, transkriptiotekijä

WAP, Whey Acidic Protein

Wnt

Zeb1, Zeb2 , transkriptiotekijä

Aluksi kuulijat saivat valaisevan esityksen rintarauhasrakenteessa tapahtuvista soluliikkeistä ja solun siirtymisestä epiteeliasemasta mesenkymaaliseksi (EMT) ja metastasoimisesta.

EMT- yhteydessä näkyi mys MMPs osuus, matrix metalloproteinaasit, jotka hajoittavat matrixia ja auttavat solua migroitumaan ympäröivään stromaan Migroiduttuaan mesenkyymiin muuntunut solu voi invasoitua verisuoneen ja sieltä taas extravasoitua stroomaan . Tämän takia asetan artikkelin MMP blogiin.

• Epiteliaalisesta mesenkymaaliseksi muuttuminen (EMT)( Epithelial-mesenchymal transition)

Epiteliaalisuus (E) tai mesenkymaalisuus (M) solun fenotyypissä ei ole aina pysyvä ominaisuus. Kehityksen aikana on kriittistä, että soluilla on kykyä morfologisiin muutoksiin ja käyttäytymisiin, jotta morfogeneesi olisi normaali. Tätä kykyään ne ilmentävät konvertoitumalla epiteliaalisen ja mesenkymaalisen fenotyypin kesken. Näitä muuttumisprosesseja, siirtymisiä (T, Transition) sanotaan epiteliaalis-mesenkymaaliseksi transitioksi ( EMT) ja mesenkymaalis-epiteliaaliseksi transitioksi (MET),

EMT ja MET ovat kehitysvaiheiden aikana kriittisiä tapahtumia, kuten gastrulaatiossa, neuraalipoimun ja sydämen läppien muodostumisen aikana samoin kuin muissakin morfogeneetisissä taaphtumissa. EMT tapahtumaa on havaittu myös rintarauhastiehyiéitten haaroittumisvaiheen aikana.

EMT käsittää sellaisten geenien aktivoitumisen, jotka ovat kriittisiä luomassa mekanismia, jolla solu voi migroitua solunulkomatrixin (ECM) läpi . Epiteelisolut liittyvät toisiinsa erilaisilla liitoksilla ( tiiveillä liitoksilla tight junctions, adheesioliitoksilla adherens junctions ja desmosomeilla, desmosomes) .

EMT- tapahtumassa nämä liitoskohdat löyhtyvät sallien epiteliaalisten solujen erkanemisen toisistaan, ne menettävät polarisuutena , puolisuutensa, ( huippu= apikaalinen, apical – pohja=basaalinen, basal ) ja ne muuttuvat liikkuviksi ( motile) .

E- Cadherin on solu-solu- liitosmolekyyli, (C- C Adhesion Molecule) epiteelissä. Se sekä epiteelispesifiset integriinit korvautuvat nyt mesenkymaalisilla vastineilla , mesenkyymille spesifisellä N-Cadheriinilla ja integriineillä , jotka ovat spesifisempiä siirtyneitten soluijen adheesioon.

Epiteliaalinen intermediäärifilamentit, sytokeratiinit saavat sijaansa vimentiinin

Allaolevan basaalikalvon hajoittaa matrixmetalloproteinaasit (MMPs) ja solu migroituu ympäröivään stroomaan.

Kaukaiseen paikkaan migroitumisen jälkeen mesenkymaaliset solut saattavat palata epiteliaaliseen fenotyyppiinsä EMT:lle käänteisellä , MET tapahtumalla ( Mesenchymal Epithelial Transition)

Sen lisäksi, että EMT on kehitykselle kriittinen se osallistuu myös haavan paranemiseen

Haavan reunan keratinosyytit käyvät läpi EMT- ja MET- tapahtumia haavan paranemisprosessissa.

EMT- tapahtuma tai EMT:n kaltaisia tapahtumia on myös fibroosin kehittymisessä ja syövän metastasoinnissa.

On samankaltaisuuksia ja eroavuuksi siinä EMT- prosessissa mikä tapahtuu kehityksen aikana ja muissa prosesseissa, minkä takia voidaan siis  luokitella kolme erilaista EMT tyyppiä:

Tyyppi 1 EMT viittaa kehitysvaiheen EMT tapahtumaan

Tyyppi 2 EMT esiintyy haavan paranemisen kuluessa ja fibroosin kehittymsessä.

Tyyppi 3 EMT liittyy syövän metastasoitumiseen.

Eräs ero EMT 1- tyypin sekä EMT 2- ja EMT 3-tyyppien kesken on se, että alkiossa ei esiinny tulehduksellista vastetta, kuten näissä jälkimmäisissä.

Mitä molekyylit osallistuvat toimintaan EMT prosessissa?

EMT:tä  pitää yllä  transkriptiotekijöiden verkosto ja niihin kuuluu Snail1, Snail2 ( myös näitä kutsutaan nimellä Slug), ja Snail3, Zeb1 ja Zeb2, Twist1 ja Twist2 ja muitakin.

Näiden ilmeneminen triggeröityy esiin vasteena solun ulkoisille signaaleille, joita tulee solun mikromiljööstä.

Vahvoja EMT- induktoreita löytyy kasvutekijöistä:

Niitä ovat TGF- beta-perhe, EGF, FGF ja PDGF.

Myöskin Wnt, Notch, Hedgehog ja NF-kB.

Reseptorityrosiinikinaasit (RTKs) kuten muun tyyppisetkin reseptorit ja laaja skaala signaaliteitä välittävät EMT- tapahtumaa alkavia alkusignaaleita, ja moni signaalitie tekee yhteistyötä ,jotta muuttuma mesenkymaaliseksi fenotyypiksi alkaa tapahtua.

Ras ja Src- teitten aktivoituminen on mukana löyhdyttämässä adheesioliitoksia ja desmosomeja ja uudellen muovaamassa sytoskeletonia säätelemällä Rho -perhettä - GTPaasientsyymeitä .

Mikromiljöön hypoksia voi myös ohjelmoida esiin EMT:tä kehityksen aikana tai tuumorin progredioituessa.

Pääasiassa HIF-1 , hypoksiaa indusoiva tekijä 1 , välittää hypoksista vastetta Twist-säädöllä.

Saattaa olla, että MikroRNA , 200miRNA , voi olla osallistumassa EMT ja MET tilojen käänteiseen vaihteeseen ( reversible switching between epithelial and mesenchymal state)

EMT syövässä  (  Tämä  EMT on  terveen epiteelisolun järjestäytyneisyyden, poolisuuden ja  puolisuuden   luhistumaa  muodoltaan  muuntuneeksi, irtautuvaksi, liikkuvaksi,  pahanlaatuisuuteen kehkeytyväksi  soluksi joka liikkuu toiseen soluaitioon, mesenkyymiin, epiteelin  matrixin  proteolyyttisesti löyhdyttyä)

Geneettiset ja epigeneettiset tapahtumat johtavat syövässä syöpäsolun fenotyypin muuntumisiin. Nämä muutokset ilmenevät selvimmin, kun syöpäsolu lähtee epiteeliasemastaan ja alkaa lopulta  metastasoida. Saattaa olla että tuumorin invasiivisen eturintaman karsinomasolut menettävät epiteliaalisia kantojaan ja hankkivat mesenkymaalisen fenotyypin. Osaltaan vaikuttaa myös muutosta kohti mesenkymaalista fenotyyppiä ne signaalit, joita pitää yllä uuden sijaintiympäristön, mesenkyymin , strooman, stromasolut erittämällä  kasvutekijöitä ja sytokiinejä.

Karsinomasolulle tarpeelliset fenotyyppiset muutokset, jotta se irtoaisi epiteelistä, näyttävät olevan signaaliteiltään ja alavirran effektoreiltaan korkea-asteisesti samankaltaisia kuin ne, joita esiintyy kehityksen aikaina vaikuttamassa alkiolle normaalia  EMT- tapahtumaa.

Tämän takia EMT- tapahtuman tai EMT:n kaltaisia tapahtumia on havaittu olevan osallistumassa tuumorin invaasioon ja metastasoitumiseen erityisesti metastaasin varhaisvaiheissa kiihdyttämässä solujen leviämistä ja täten luomassa kiertäviä tuumorisoluja (CTC).

On havaittu että kauempana sijaitsevissa elimissä esiintyvään metastasoitumiseen lienee osallisena käänteisprosessi MET:  Solu otaa takaisin epiteliaalisia ominaisuuksiaan,  mutta väärässä paikassa, ei epiteelissä.

EMT- prosessiin liittyvien transkriptiotekijöiden konstitutiivinen  (normaali , aina toimiva) ilmeneminen vaimentaa metastaasien muodostumista, mikä puolestaan viittaisi siihen , että EMT- transkriptiotekijöiden siinä tapauksessa täytyy olla alassäätyneinä, jotta metastaaseja muodostuisi.

Lisäksi - toisaalta- on havaittu, että rintasyövän metastaaseissa on E-Cadheriinin ilmenemä vahvaa.Tämä viittaa siihen, että epiteliaalisten merkitsijöiden uudelleen ilmaantuminen on välttämätöntä metastaasien muodostumiselle.( Siis  solut ovat kaukana lähtöpaikasta ottaneet taas  epiteliaalisia ominaisuuksia)

On vaikeaa tutkia EMT- tapahtumaa ihmistuumoreista, koska EMT ilmiönä katsotaan ohimeneväksi tapahtumaksi

( Vertaa: ihminen menee ovesta taloon- oven kohta on vain hetki- kuten EMT tapahtuma on hetki siirryttäessä aitiosta toiseen).

Jokainen tuumorinäyte edustaa vain yhtä ainota hetkeä. Kuitenkin on tutkittu intensiivisesti EMT- ilmiötä soluviljelmistä ja eläinmalleista. On osoitettu, että syöpäsolumalleissa EMT- tapahtuman alku ja progrediointi (eteneminen) käsittää monien signaloivien teitten osallistumisen ja usein vielä erilaisten signaaliteitten yhteistyön.

EMT-tapahtumaa voi ohjelmoida myös  Raf/MAPK- ja PI3K-teitten aktivoitumisen kautta ( non- SMAD- välitteisesti)

sekä reseptorityrosiinikinaasien ( RTKs, esim EGFR) ylimäärin esiintymä

tai konstitutiivinen Ras - signalointi

ja nämä johtavat transkriptiotekijöiden (Snail, Slug, Twist ja Zeb1) ilmenemiseen.(Käsittääkseni  niitä  ei ilmene ennen kuin EMT on jostain syystä  jo  alkanut).

Moni tutkimus viitaa siihen, että TGF- beta on "master regulator" EMT- tapahtumassa, siis mestarisäätelijä. On havaittu myös, että EMT- tapahtumaa aiheuttaa yhteistyö TGF-beta tekijän ja Ras tai RTK entsyymien kanssa- missä taas voi   olla heijastus epätasapainosta( Rintasyövästä tiedetän, että TGFbeta/SMAD  akseli on siinä murtunut ja TGFbeta jatkaa kuitenkin muitten  signalointiteitten puolella, mutta  SMAD ei  silppuroidukaan,   vaan  jää jäljelle tekemään  jotain epäloogista)

Mesenkymaalisia merkitsijöitä on havaittu ilmentyvän sellaisisa rintasyövissä, jotka ovat basaalista tai triple- negatiivista alatyyppiä. Kuitenkin sellaiset tuumorit sisältävät myös epiteliaalisia merkitsijöitä, mikä taas viitaa siihen, että niissä on tapahtunut ositainen EMT( partial EMT) .

On oletettu.että EMT tapahtuma voi generoida, kehkeyttää, kiertäviä syöpäsoluja(CSC), mutta kuitenkin näiden solujen alkuperä on vielä väittelyn aihe. On voitu osoittaa, että rinnan epiteliaalisoluissa transkriptiotekijöiden Twist1 tai Snail ilmenemä tai TGF-beta kasvutekijällä käsitteleminen lisää sellaisten solujen määrää, joilla on kykyä olla kierteleviä syöpäsoluja  (Cluster of Difference CD 44 high/ CD24low) .

Rintasyöpämetastaase potevilla henkilöillä ilmenee kiertävissä syöpäsoluissa (CSC) samaan aikaan EMT- merkitsijöitä ja kantasolun (CSC)  merkitsijöitä.

Mitkä tärkeät tekijät kontrolloivat EMT tapahtuman

Yllä on kuvattu monia tekijöitä, jotka osallistuvat EMT- tapahtumaan, Tutkijan Gisela Nilssonin väitöskirjatyössä kohdistutaan erityisesti neljään eri tekijään, joiden on osoitettu osallistuvatn rintasyövän kehittymiseen ja EMT- tapahtumaan. Seuraavassa työn johdannon jaksossa hän kuvaa näitä neljää tekijää:

E-Cadherin

E- tarkoitaa epiteeliä ja tämä tekijä tunnetaan myös nimellä cadherin-1 (CDH-1), uvomorulin , L-CAM ja se kuuluu tyypin 1 klassisen cadherin perheeseen ja on päämolekyyli CM molekyyleissä (CAM= Cell Adhesion Molecule)

C-erbB2

C-erbB perhe on reseptorityrosiinikinaaseja (RTK) , joihin kuuluu epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR, c-erbB1, HER1); c-erbB2 (Neu, HER2); c-erbB3 (HER3); c-erbB4 (HER4). Näitä aktivoi usea ligandi kuten EGF, TGF-alfa ja heregulin.
C-erbB2 on yleinen piirre rintasyövässä ja sen kohonnut ilmenemä nähdään 15 - 30% rintatuumoreista. Sitä vastaan on monoklonaalinen vasta-aine (MoAB)  trastuzumab. (Herceptin) . Ylimäärä c-erbB2  estää E- cadheriinin transkriptiota. C-erbB2 vaikuttaa soluadheesioon ja migraatioon, joten sillä lie osuus metastasointiin.
Jos tuumori on c-erbB2 +  (positiivinen),  hoidossa on usein käytetty tyrosiinikinaasi-inhibiittoria lapatinib.

 Väitöskirjan työosuus Paper I: Loss of E-cadherin expression is not a prerequisite for c-erbB2-induced- mesenchymal transition
( It is  consequence rather than  a cause of c-erbB2- induced EMT--)

Nuclear factor 1-C2 (NF1-C2)

Tämä tumatekijä  kuuluu   NF1- transkriptiotekijöitten  perheeseen. NF1- geeniperheesen kuuluu neljä geeniä NF1-A, NF1-B, NF1-C ja NF1-X.
NF1-C2 on spesifinen isoformi. Se mm.  aktivoi p53 ja voi suojata rintarauhasta proliferaation aikaiselta tumorigeneesiltä.  Se on vahva  hyvän prognoosin merkki. ( Jos tuumori pääsee progredioitumaan, NF1-C2   katoaa, jolloin on menetetty tekijä,  joka voi vaimentaa  EMT- tapahtumaa)

Väitöskirjan työosuus Paper III: Nuclear Factor 1-C2 is a powerful   prognostic marker in breast cancer

Forkhead box F1 (FoxF1)

Fox- proteiinit käsittävät transkriptiofaktoriperheen. Niitten geenejä on viisikymmentä ihmisen genomissa (FoxA- FoxS) . Fox -proteiinit sitovat DNA:ta tunnistavan motiivin kohdalta. Tämän motiivin ulkopuolella olevat nukleotidit ovat tärkeät eri Fox-proteiinien spesifisyydelle. Ajallinen, tilavuudellinen ja asiayhteyksellinen riippuvuus merkitsee myös. Esim kehittyvässä keuhkossa Fox1 ja Fox2  kattavat tosiaan (overlap) mutta niiden ilmenemismalli on erilainen,  joten näillä voi olla samanlaisia ja toisistaan riippumattomia funktioita.

Fox- proteiinien on arveltu toimivan joko tuumorisuppressoreina tai onkogeeneinä. Ensimmäinen tutkimus joka osoitti  FoxF1:n tumorigeneesissä tuli tämän väitöskirjan tekijöitten laboratoriosta. Koe-eläintutkimuksissa hiirellä Fox1 indusoi EMT- tapahtuman, migraation ja invasoituvuuden. Lisäksi vahvistettu Fox F1 expressio lisäsi xenograftissa tumorigeneesiä. Se on myös tärkeä mesenkymaalisessa solumigraatiossa suoraan vaimentaen  integriini-b2 ilementymää Sillä näyttää olevan  osuutta keuhkosyöpään liittyvässä fibroblastimigraatiossa  stimuloijana ja tuumorin kasvattajana.  Se myös kiihdyttää invaasiota.

Väitöskirjan työosuus Paper II: Forkhead Box F1 promotes breast cancer cell migration by upregulating lysyl oxidase (LOX)  and suppressing Smad2/3 signalin.