Lubrisiinia hajoittavat entsyymit

LÄHDE:  Thesis  Liaqat Ali. Bio.Lubrication. Strutural investigation of Lubricin and its glykosylation.
Sitaatteja joita löydän  väitöskirjasta:'

In vitro; in vivo:

"Lubricin has been found to be extensively degraded by papain, trypsin and pronase and to  a lesser extent by pepsin. (Flannery et al. 1999).
Other proteases such as neutrophil elastase ( a serine protease) and cathepsin B ( a cysteine protease) are also able to degrade lubricin in vitro (Jones et al. 2003; Elsaid et al. 2005)

Interestingly lubricin tryptic peptides were detected as low as the 30 - 65 kDa region. These fragments are unlikely to contain the full  mucin like domain,  but more likely an N- or C-terminal domain with a portion of mucin-like domain( non-glycosylated N-terminus has a mass of 33,8 kDa and the C-terminus 35,4 kDa)

So far it is not clear whether they were from unique cleavages along lubricin sequence or just randomly excised in vivo 

Evidence has indicated N-terminus of lubricin is more sensitive to neutrophil elastase (Elsaid et al. 2005).
Purified neutrophil elastase has been shown to damage cartilage explants in vitro (Burkhardt et al.  1988)
Also neutrophil elastase, and not MMPs, can destroy the superficial layer of cartilage where lubricin locates.
Consequently, MMPs have better access to cartilage molecules in less superficial layers of cartilage (Jasin et Taurog 1991).p. 145. Paper II.


"In cartilage, MMPs are  the principal proteases capable of degrading a wide variety of the extracellular matrix components (Nagase et  Woessner 1999=)
The released fragments of lubricin together with other synovial residual proteins and cartilage matrices floating in synovial fluid /SF)  may be detected by biochemical or immunochemical assaey. The profile of the protein fragments within synovial fluid may represent diagnostic pr prognostic biomarker for the degenerative  diseases." p. 133 Paper II.


"Proteins identified in enriched synovial fluid sample:
Fibronectin
Basement specific membrane specific heparan sulfate proteoglycan core protein
Apolipoprotein B-100
Lubricin
Alpha-2-macroglobulin
Aggrecan core protein
Serum albumin (HSA)"
P. 141, Paper II.

Väitöskirja nivelnesteen voiteluaineesta nimeltä lubricin 20.11. 2014

Tänään oli kehon rheologisia molekyylejä koskeva väitöstilaisuus  Göteborgissa. nyt asia koski nivelnesteen molekyyliä,  runsaastiglykosyloitunutta musiinia lubricin. musiinia, suomalaisittain lubrisiini.
Västäväitelijä  tuli Amsterdamista asti  professori  tri Manfred Wuhrer ja hän esitti ensin valaisevasti  tämän proteiininmodifikaatiojärjestelmän, glykosylaation, periaatteet.Väitöskirjansa esitti Liaqat Ali Göteborgista.  opponentin ja respondentin keskustelu valaisi edelleen  yksityiskohtia työstä, samoin kysymykset joita tutkimuslautakunnasta  tehtiin.
(Minua henkilökohtaisesti väitöskirja kiinnosti lähdetietona glykosylaatiosta, koska  se on tärkeä momentti  virusten infektoivissa partikkeleissa, varsinkinnäinä viikkoina lukemassani ebolaviruksessa juuri musiininkaltainen jakso on  ihmiselle kohtalokkain. Valitsin tämän päivän väitöstilaisuuksista sen takia   tämän biomolekulaarista asiaa käsittelevän).

Thesis:  http://hdl.handle.net/2077/36754
Liaqat Ali. Bio-Lubrication. Strutural investigation of Lubricin and its glykosylations. 
ISBN 978-91-628-9206-7

Koetan suomentaa abstraktista väitöksen tekijän  tiivistelmää, tarkoitusta,  työtä , metodeja ja tuloksia.  Yhteenveto (Sammanfattning)  on myös ruotsinkielellä inernetlähteessä saatavilla. .

Meidän liikkuessamme suojaa allaolevaa luupintaa naarmutukselta ja kulumiselta     nivelruston ja nivelnesteen yhteistyö. Ne saavat suojan aikaan vähentämällä  nivelen friktiota eli  kitkaa, hankausta.
Nivelnesteen voiteleva vaikutus johtuu ennenkaikkea ruston pintaan ankkuroituneista biomolekyyleistä kuten fosfolipideistä, hyaluronihaposta ja lubrisiini ( voiteluaine-) glykoproteiinista. Nivelen tulehtuessa ja nivelvammassa voi niiden vuorovaikutus  rustopinnan kanssa häiriytyä niin, että nivelen kitka ja kuluminen pääsee lisääntymään   pahentaen taudinkuvaa.  On jo aiemmin  kiinnitetty huomiota nivelreuman ja artroosin yhteydessä  muutoksiin, joita  tässä  musiininkaltaisessa  hyvin runsaasti glykosyloituneesssa  lubrisiinissa tapahtuu. Oletetaan  muuttumisen  johtuvan lubrisiinin  glykosyloitumisesta, mutta  se saattaajohtua myöskin lubrisiiniproteiinimolekyylin hajoamisesta, koska on havaittu nivelnesteessä lubrisiinifragmentteja niveltulehduksen yhteydessä.   Näistä löydöistä päätellen voitaisi lubrisiinia myös käyttää yhtenä biomerkitsijänä niveltautien tunnistamisessa- arvelee väitöskirjan tekijä. (Opponentti taas huomautti, että  tämä invasiivisena toimenpiteenä  ei olisi  yksinkertainen seikka: neula niveleeseen näytteen otossa) 

 Jotta saataisin parempi käsitys lubrisiinin voitelevasta kyvystä ja  sen osallisuudesta niveltulehdustauteihin, alettiin  tutkia lubrisiinin kemiallista rakennetta ja  glykosyloitumista.
Koska sialiinihappoa sisältävät oligosakkaridit ovat lubrisiinin pääasialliset glykaanit, luonnehdittiin niitä tutkimuksen  yhtenä johdattavana osana.  Irrotettuja lubriinioligosakkarideja käsiteltiin alfa-2-3  sidos spesifisellä sialidaasientsyymillä ja verrattiin tuotteiden MS/MS kirjoja viitekirjoon UniCarb-DB  massaspektrometrisiin tietueissa. 
Tulokset osoittivat, että 2-tyviset  (core2) lubrisiinirakenteet omasivat vain  alfa2-3 sidoksisia sialiinihappoja ( sidos vasemmalle) , kun taas 1-tyviset(Core1) rakenteet sitoivat sialiinihappoa alfa 2-6 tyyppisesti. (sidos oikealle).
Toisessa kokeessa   massaspektrometrialla analysoidut glykopeptidit  osoittivat  STP-domeeninsa ja TR- aminohapposekvenssinsä olevan  O-glykosylaation substraattina.  Lubrisiinin musiinidomeeni  sisältää  STP aminohappoja, seriiniä, treoniinia ja proliinia.  Toistojakso (TR) omaa sekvenssin EPAPTTPK ( glutamiinihappo, proliini, alaniini, kaksoistreoniini, proliini, lysiini).

 GALNT- entsyymien ekspressioanalyysi fibroblastien kaltaisista synoviosyyteistä  osoitti  mitkä entsyymit oletettavasti  vastasivat lubrisiinin glykosylaation aloittamisesta. Transkriptoitui ensinnäkin tavallisimmin esiintyviä GALNT1 ja GALNT2 , mutta  vahvasti ilmeni myös kudosspesifisempiä GALNT5 ja GALNT15- entsyymejä. Tulokset geenitranskriptioanalyysistä viittaisivat  siihen, että lubrisiinin glykosylaatio vaatisi  ainutlaatuisen kombinaation  transferaasigeenejä.

Yhteenvetona tutkimus selvitti  musiininkaltaisen domeenin negatiivisesti varautuneitten siaalihappojen tekevän lubrisiinimlekyylistä luonteeltaan amfoteerisen, koska proteiinin  arginiini(R) ja lysiini(K)-pitoinen ydinosa on positiivisesti latautunutta.  Glykosylaatio ja sialylaatiokohtien lukumäärä  osoittautui  essentielliksi tässä amfoteerisessä luonteessa ja  lie tärkeä lubrisiinin funktiolle amfoteerisenä biolubrikanttina.


Tätä   viimeksi mainittua seikkaa valaisi professori  M.Wuhrer  kuvaten  PSA-NCAM, PolySailic Acid-NCAM  neuronin puolelta. (Nature Review)http://www.pnas.org/content/103/45/16989/suppl/DC1